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引物設(shè)計(jì)
細(xì)心地進(jìn)行引物設(shè)計(jì)是PCR中zui重要的一步。理想的引物對只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其他序列退火。設(shè)計(jì)糟糕的引物可能會同擴(kuò)增其他的非目的序列。下面的指導(dǎo)描述了一個可以增加特異性的引物所具有的令人滿意的特點(diǎn)：
1.典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列*性，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。
2.選擇GC含量為40％到60％或GC含量映像模板GC含量的引物。
3.設(shè)計(jì)5'端和中間區(qū)為G或C的引物。這會增加引物的穩(wěn)定性和引物同目的序列雜交的穩(wěn)定性。
4.避免引物對3'末端存在互補(bǔ)序列，這會形成引物二聚體，抑制擴(kuò)增。
5.避免3'末端富含GC。設(shè)計(jì)引物時保證在zui后5個核苷中含有3個A或T。
6.避免3'末端的錯誤配對。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。
7.避免存在可能會產(chǎn)生內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)的序列，這會破壞引物退火穩(wěn)定性。
目的序列上并不存在的附加序列，如限制位點(diǎn)和啟動子序列，可以加入到引物5'端而不影響特異性。當(dāng)計(jì)算引物Tm值時并不包括這些序列，但是應(yīng)該對其進(jìn)行互補(bǔ)性和內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)的檢測。
有時候，對于引物設(shè)計(jì)僅了解有限的序列信息。比如，如果僅知道氨基酸序列，可以設(shè)計(jì)兼并引物。兼并引物是指代表編碼單個氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。為了增加特異性，可以參考密碼子使用表，根據(jù)不同生物的堿基使用偏好，減少兼并性。次黃嘌呤可以同所有的堿基配對，降低引物的退火溫度。不要在引物的3'端使用兼并堿基，因?yàn)?'端zui后3個堿基的退火足以在錯誤位點(diǎn)起始PCR。使用較高的引物濃度（1μM到3μM），因?yàn)樵S多兼并混合物中的引物不是特異性針對目的模板。
引物退火溫度
引物的另一個重要參數(shù)是熔解溫度（Tm）。這是當(dāng)50％的引物和互補(bǔ)序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時的溫度。Tm對于設(shè)定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設(shè)定比引物的Tm低5℃。
設(shè)定Tm有幾種公式。表4列出確定引物Tmzui常用的兩種方法。*個公式來源于高鹽溶液中的雜交，適用于小于18堿基的引物。第二個公式根據(jù)GC含量估算Tm。確定引物Tmzui可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級結(jié)構(gòu)和相鄰堿基的特性預(yù)測引物的雜交穩(wěn)定性。大部分計(jì)算機(jī)程序使用近鄰分析法。
根據(jù)所使用的公式及引物序列的不同，Tm會差異很大。因?yàn)榇蟛糠止教峁┮粋€估算的Tm值，所有退火溫度只是一個起始點(diǎn)。可以通過分析幾個逐步提高退火溫度的反應(yīng)以提高特異性。開始低于估算的Tm5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。為獲得*結(jié)果，兩個引物應(yīng)具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過5℃，就會引物在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯誤起始。如果兩個引物Tm不同，將退火溫度設(shè)定為比zui低的Tm低5℃。或者為了提高特異性，可以在根據(jù)較高Tm設(shè)計(jì)的退火溫度先進(jìn)行5個循環(huán)，然后在根據(jù)較低Tm設(shè)計(jì)的退火溫度進(jìn)行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴(yán)緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。
遞減PCR
遞減PCR通過在PCR的前幾個循環(huán)使用嚴(yán)緊的退火條件提高特異性。循環(huán)開在比估算的Tm高大約5℃的退火溫度下開始，然后每個循環(huán)降低1℃到2℃，直到退火溫度低于Tm 5℃。只有同同源性zui高的目的模板會被擴(kuò)增。這些產(chǎn)物在隨后的循環(huán)中繼續(xù)擴(kuò)增，并會將擴(kuò)增的非特異性產(chǎn)物排擠出去。遞減PCR對于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法較為有用，如AFLP DNA指紋分析。
引物濃度
引物的濃度會影響特異性。*的引物濃度一般在0.1到0.5μM。較高的引物濃度會導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。
為了確定引物濃度，可以在260nm（OD260）測量光密度值。然后使用光吸收值和微摩消光系數(shù)的倒數(shù)（nmol/OD），通過Beers法則（公式1）計(jì)算引物濃度。微摩消光系數(shù)可以使用公式2計(jì)算。與大分子雙鏈DNA可以使用平均消光系數(shù)不同，確定引物的濃度必須使用計(jì)算的消光系數(shù)。這是因?yàn)橐镙^短，堿基組成差異很大。在Gibco/BRL定制引物的質(zhì)檢報告中包含了消光系數(shù)（OD/μmol）和消光系數(shù)的倒數(shù)（μmol/OD）。另外，不要使用寡聚核苷酸作為標(biāo)準(zhǔn)，在EB染色的膠上估算引物濃度，因?yàn)橐锖蜆?biāo)準(zhǔn)的染色能力根據(jù)序列不同而差異很大。
引物純度和穩(wěn)定性
定制引物的標(biāo)準(zhǔn)純度對于大多數(shù)PCR應(yīng)用是足夠的。因脫鹽而除去的苯甲酰基和異丁酰基很少，因此不會干擾PCR。部分應(yīng)用需要純化，以除去在合成過程中的任何非全長序列。這些截?cái)嘈蛄械漠a(chǎn)生是因?yàn)镈NA合成化學(xué)的效率不是100％。這是個循環(huán)過程，在每個堿基加入時使用重復(fù)化學(xué)反應(yīng)，使DNA從3'到5'合成。在任何一個循環(huán)都可能失敗。較長的引物，尤其是大于50個堿基，截?cái)嘈蛄械谋壤艽螅赡苄枰兓?nbsp;
引物產(chǎn)量受合成化學(xué)的效率及純化方法的影響。Life Technologies以一個zui小OD單位確保總寡核苷的產(chǎn)量。定制引物以干粉形式運(yùn)輸。在TE重溶引物，使其zui終濃度為100μM。TE比去離子水好，因?yàn)樗膒H經(jīng)常偏酸，會引起寡核苷的水解。
引物的穩(wěn)定性依賴于儲存條件。應(yīng)將干粉和溶解的引物儲存在-20℃。以大于10μM濃度溶于TE的引物在-20℃可以穩(wěn)定保存6個月，但在室溫（15℃到30℃）僅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室溫（15℃到30℃）zui多可以保存2個月。
熱啟動
熱啟動PCR是除了好的引物設(shè)計(jì)之外，提高PCR特異性zui重要的方法之一。盡管Taq DNA聚合酶的*延伸溫度在72℃，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在進(jìn)行PCR反應(yīng)配制過程中，以及在熱循環(huán)剛開始，保溫溫度低于退火溫度時會產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會被有效擴(kuò)增。在用于引物設(shè)計(jì)的位點(diǎn)因?yàn)檫z傳元件的定位而受*，如site-directed突變、表達(dá)克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構(gòu)建和操作，熱啟動PCR尤為有效。
限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應(yīng)液，并將其置于預(yù)熱的PCR儀。這種方法簡單便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能*消除非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增。
熱啟動通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀達(dá)到變性溫度。包括延緩加入Taq DNA聚合酶在內(nèi)的大部分手工熱啟動方法十分煩瑣，尤其是對高通量應(yīng)用。其他的熱啟動方法使用蠟防護(hù)層將一種基本成分，入鎂離子或酶，包裹起來，或者將反應(yīng)成分，如模板和緩沖液，物理地隔離開。在熱循環(huán)時，因蠟熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起。象手動熱啟動方法一樣，蠟防護(hù)層法比較煩瑣，易于污染，不適用于于高通量應(yīng)用。 Platinum DNA聚合酶對于自動熱啟動PCR來說方便。Platinum Taq DNA聚合酶的成分為復(fù)合有抗Taq DNA聚合酶單克隆抗體的重組Taq DNA聚合酶。抗體在PCR配制，以至于在室溫的延時保溫過程中抑制酶的活性。Taq DNA聚合酶在變性步驟的94℃保溫過程中被釋放到反應(yīng)中，恢復(fù)了*的聚合酶活性。同經(jīng)化學(xué)修飾用于熱啟動的Taq DNA聚合酶相比，Platinum酶不需要在94℃延時保溫（10到15分鐘）以激活聚合酶。使用PlatinumTaq DNA聚合酶，在94℃進(jìn)行2分鐘就可以恢復(fù)90％的Taq DNA聚合酶活性。
鎂離子濃度
鎂離子影響PCR的多個方面，如DNA聚合酶的活性，這會影響產(chǎn)量；再如引物退火，這會影響特異性。dNTP和模板同鎂離子結(jié)合，降低了酶活性所需要的游離鎂離子的量。*的鎂離子濃度對于不同的引物對和模板都不同，但是包含200μM dNTP的典型PCR起始濃度是1.5mM（注意：對實(shí)時定量PCR，使用3到5mM帶有熒光探針的鎂離子溶液）。較高的游離鎂離子濃度可以增加產(chǎn)量，但也會增加非特異性擴(kuò)增，降低忠實(shí)性。為了確定*濃度，從1mM到3mM，以0.5mM遞增，進(jìn)行鎂離子滴定。為減少對鎂離子優(yōu)化的依賴，可以使用Platinum Taq DNA聚合酶。Platinum Taq DNA聚合酶能夠在比Taq DNA聚合酶更廣的鎂離子濃度范圍內(nèi)保持功能，因此僅需較少的優(yōu)化.
促進(jìn)PCR的添加劑
退火溫度，引物設(shè)計(jì)和鎂離子濃度的優(yōu)化足以對大多數(shù)模板進(jìn)行高特異性的擴(kuò)增，但是，某些模板，包括高GC含量的模板，需要其他的措施。影響DNA熔解溫度的添加劑提供了提高產(chǎn)物特異性和產(chǎn)量的另外一種方法。為獲得的結(jié)果需要模板的*變性。另外，二級結(jié)構(gòu)會阻止引物結(jié)合和酶的延伸。PCR添加劑，包括甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜堿以及PCRx Enhancer Solution可以增強(qiáng)擴(kuò)增。它們可能的機(jī)理是降低熔解溫度，從而有助于引物退火并輔助DNA聚合酶延伸通過二級結(jié)構(gòu)區(qū)。PCRx Solution還有其他優(yōu)點(diǎn)。在同Platinum Taq DNA聚合酶和Platinum Pfx DNA聚合酶一起使用時，僅需很少的鎂離子優(yōu)化。這樣，將Platinum技術(shù)同添加劑結(jié)合，增強(qiáng)了特異性，同時減少了第三種方法-鎂離子優(yōu)化的依賴。為獲得*結(jié)果，應(yīng)優(yōu)化添加劑的濃度，尤其是會抑制Taq DNA聚合酶的DMSO，甲酰胺和甘油。
巢式PCR
使用巢式引物進(jìn)行連續(xù)多輪擴(kuò)增可以提高特異性和靈敏度。*輪是15到20個循環(huán)的標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增。將一小部分起始擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋100到1000倍加入到第二輪擴(kuò)增中進(jìn)行15到20個循環(huán)。或者，也可以通過凝膠純化將起始擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行大小選擇。在第二輪擴(kuò)增中使用一套巢式引物，其可以同*套引物內(nèi)側(cè)的靶序列結(jié)合。巢式PCR的使用降低了擴(kuò)增多個靶位點(diǎn)的可能性，因?yàn)橥瑑商滓锒蓟パa(bǔ)的靶序列很少。而使用同樣的引物對進(jìn)行總數(shù)相同的循環(huán)（30到40）會擴(kuò)增非特異性靶位點(diǎn)。巢式PCR可以增加有*靶序列（如稀有mRNA）的靈敏度，并且提高了困難PCR（如5' RACE）的特異性。
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